Der jetzige Stadtteil Waldau wurde im Jahre 782 erstmals und 806 als Waladala in der Chronik des Klosters Moissac (heute in der Bibliothèque Nationale de France in Paris) erwähnt. Am 29. Juli 961 erscheint in einer Schenkungsurkunde des Kaisers Otto I. eine civitas Brandanburg.

Neben dieser Burg bestand vermutlich auch auf dem Westufer der Saale eine weitere frühmittelalterliche Befestigungsanlage, die aus dem in der zweiten Hälfte des 10. Jahrhunderts zum Gernroder Klosterhof gewordenen ehemals fränkischen Königshof „Waladala“ hervorgegangen sein könnte. Auf dem Gebiet der Talstadt kann im Bereich der Neustädter Pfarrkirche St. Nikolai eine frühstädtische Fernhandelskaufmannssiedlung angenommen werden. Nach der Zurückdrängung des Einflusses der Askanier auf das Kloster Nienburg und den dort befindlichen bedeutenden Saaleübergang im Jahr 1166 kam der Errichtung eines sicheren Flussüberganges in Bernburg eine erhöhte Bedeutung zu.

Gemeinsam mit dem Wiederaufbau der Burg ab der zweiten Hälfte des 12. Jahrhunderts wurde auch die Bergstädter Pfarrkirche St. Aegidien neu errichtet. Das Aegidien-Patrozinium und der aufwändige Bautyp dieser Kirche als romanische Basilika mit Vierungsturm deuten darauf hin, dass der Bau der Bergstädter Pfarrkirche Teil eines Ansiedlungsprojektes für Neusiedler aus den westlichen Teilen des Reiches war, die sich nun zur Intensivierung des askanischen Landesausbaus in Bereich der Bernburger Burg niederlassen sollten. Gleichzeitig entstand vor der Burg, im Bereich der heutigen Fischergasse, eine slawische Kietz-Siedlung. Der Verkauf von landwirtschaftlichen Produkten an Fernhandelskaufleute schuf die Grundlage für die Entstehung einer Nahmarkt- und Dienstleistungssiedlung auf dem Gebiet der Bernburger Altstadt im Saaletal. Diese entwickelte sich dann in der ersten Hälfte des 13. Jahrhunderts durch die gezielte Ansiedlung von Handwerkern und Kaufleuten und die Einbeziehung von ortsfest gewordenen Händlern der Nikolaisiedlung – die nun in einer untergeordneten, aber selbstständigen Neustadt aufging – zur gotischen Marktstadt weiter.

Der erste Beleg für eine Mühle an der Saale stammt aus dem Jahre 1219. Das Gefälle der Bernburger Saalestufe war für den Mühlenbetrieb gut geeignet. Die erste Saalebrücke wurde 1239 errichtet. Sie wurde bis ins 20. Jahrhundert immer wieder zerstört und erneuert.

1278 erhielten Altstadt und Neustadt durch Bernhard I. von Anhalt-Bernburg das Stadtrecht. 1308 wurde das Bernburger Kloster (heute St. Johannes-Hospital) erstmals erwähnt, 1326 die Bergstadt. Die regionale Legende bringt den Handlungsort jener Historie, in der sich Till Eulenspiegel als Turmbläser beim Grafen von Anhalt verdingt, mit dem Bergfried des Bernburger Schlosses in Verbindung. Da aber auf der Burg Bernburg im 15. Jahrhundert zwei Bergfriede vorhanden waren und der heutige „Eulenspiegelturm“ im Jahr 1497 noch als „keulichter thorm“ bezeichnet wurde, kann davon ausgegangen werden, dass diese Übertragung erst als Reaktion auf die Rezeption des Eulenspiegelstoffes am Bernburger Fürstenhof erfolgte. Im Jahr 1640 ist der Name „Eulenspiegel“ für den heute erhaltenen runden Bergfried der Kernburg erstmals im Bernburger Salbuch belegt. Wegen der Einfuhr unverzollter Waren auf dem Wasserweg kam es 1426 zum „Heringskrieg“, einem bewaffneten Zollstreit mit der Hansestadt Magdeburg. 1526 erfolgte die Einführung der Reformation in Anhalt-Bernburg als drittem Staat der Welt, nach Kursachsen und Anhalt-Köthen. Am 21. Oktober 1530 erhielt das Erzstift Magdeburg ein Privileg des katholischen Kaisers Karl V. zur freien Saaleschifffahrt mit gleichzeitiger Erlaubnis, das Flussbett auszubauen. Als erste Maßnahme hierzu wurde noch im gleichen Jahr mit dem Bau des Wehres in Bernburg begonnen. 1559 kam es auf Initiative des begünstigten Erzstiftes zu einem Vertrag zwischen Erzbischof Sigismund und Fürst Wolfgang von Anhalt zwecks Ausbau und Sicherung der Saaleschifffahrt. Auf dieser Grundlage begann 1560 der Bau der ersten noch hölzernen Schleuse in Bernburg. Der Bereich flussabwärts der Schleuse bis zur Saalebrücke wurde seitdem als Klein-Venedig bezeichnet, der Hang oberhalb dieses Hafens als "Schöner Winkel". Schon 1605 mussten wegen des damaligen Niederganges der Saaleschifffahrt Abgaben zum Unterhalt der Schleusen erhoben werden.

In den Hexenverfolgungen wurden 1555–1664 in Stadt und Amt Bernburg mindestens 46 Personen angeklagt. Bekannt wurde der Hexenprozess 1617–1619 gegen die Frau des Bürgermeisters Meyhen, Barbara Meyhe. Am 9. Dezember 2015 fand die Enthüllung einer Gedenktafel für die Opfer der Hexenverfolgung in Bernburg (Saale) statt am ehemaligen Pfarrhaus der Kirche St. Marien, Altstädter Kirchhof 10.

1595 zerstörte eine Überschwemmung 160 Häuser der Talstadt. 1603 wurde Bernburg Residenz- und Garnisonsstadt des Fürstentums (ab 1807 Herzogtums) Anhalt-Bernburg. Im Dreißigjährigen Krieg eroberten und plünderten im Jahre 1630 die „Holk'schen Reiter“ die Stadt, eine Pestepidemie forderte in dieser Zeit 1700 Opfer. 1666 wütete eine Feuersbrunst in der Altstadt. Die letzte Pestepidemie suchte Bernburg 1682 heim. 1697 wurde die erste steinerne Saale-Schleuse eingeweiht.

1745 wurde in Bernburg die erste Dampfmaschine für den Bergbau konstruiert. 1757 und nochmals von 1807 bis 1813 stand Bernburg unter französischer Besatzung. Tal- und Bergstadt wurden 1825 zur Stadt Bernburg vereinigt. Die Anhalt-Köthen-Bernburger Eisenbahn eröffnete 1846 Köthens dritten Bahnhof und damit Bernburgs erste Bahnverbindung zu den Stationen der Magdeburg-Köthen-Halle-Leipziger Eisenbahn-Gesellschaft (1840) sowie der Berlin-Anhaltischen Eisenbahn (1841).

Im Schloss wurde 1860 ein Bärenzwinger gebaut, um den ersten 1858 aus Russland eingetroffenen Braunbären zu halten. Der Zwinger wurde 1996 nach tierschutzgerechten Prinzipien erneuert. 1863 endete das Herzogtum Anhalt-Bernburg mit dem Tod des letzten Herzogs Alexander Carl. 1890 wurden die Solvay-Werke eröffnet, wodurch Bernburg für kurze Zeit die größte Stadt in Anhalt war. 1891 wurde die erste Stahlbrücke über die Saale errichtet. 1895 ließ der Kreis Bernburg durch die Firma Gropius & Schmieden ein neues Krankenhaus im Pavillonstil errichten.

1902 wurde die Stadt Solbad und bekam ein Kurhaus. 1913 wurde der Keßlerturm eingeweiht,benannt nach seinem Stifter, Kommerzienrat Theodor Keßler (1839–1917), Teilhaber der Bernburger Zinngießerei L. Keßler & Sohn. 1933 wurde die Stadt Bernburg kreisfrei.

1934 wurde die neue Marktbrücke eingeweiht. Während der Zeit des Nationalsozialismus war Bernburg ab 1935 wieder Garnisonsstadt und beherbergte Teile eines Infanterie-Regiments sowie eine Vielzahl von Ersatz- und Luftwaffen-Einheiten.

Im Zuge der Aufrüstung der Wehrmacht wurde nördlich von Strenzfeld das „Werk Bernburg“ der Dessauer Junkers-Flugzeugwerke errichtet, wo Ju 88 montiert und auf dem anliegenden Flugplatz von der Luftwaffe übernommen wurden. Im Zweiten Weltkrieg wurde das Werk mehrfach bombardiert.

Im November 1940 wurde vom NS-Regime in der damaligen Landes-Heil- und Pflegeanstalt Bernburg (heute Landeskrankenhaus für Psychiatrie und Neurologie) die NS-Tötungsanstalt Bernburg eingerichtet und betrieben. Zwischen 1940 und 1943 wurden dort über 14.000 Menschen im Rahmen der Euthanasieprogramme „Aktion T4“ und „Aktion 14f13“ vergast. Die 1989 neu eröffnete Gedenkstätte Bernburg für die Opfer der NS-Euthanasie befindet sich am authentischen Ort in der früheren Heil- und Pflegeanstalt bzw. dem heutigen Landeskrankenhaus.